在生物制藥領(lǐng)域，對(duì)宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)的精準(zhǔn)分析與控制是確保藥物安全與有效性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。各國(guó)法規(guī)都有關(guān)于HCPs的論述，要求必須對(duì)生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCPs降低到可接受的水平。

不同監(jiān)管機(jī)構(gòu)宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)法規(guī)要求:

• 《中國(guó)藥典》(2020版)三部規(guī)定：針對(duì)CHO細(xì)胞，HCPs殘留需要<0.05%(相當(dāng)于小于500ppm)；針對(duì)E.coli，HCP殘留需要<0.01%。
• 美國(guó)藥典USP<1132>章節(jié)規(guī)定：用一種靈敏度較高的方法檢測(cè)藥品中的HCPs，其含量應(yīng)該低于檢測(cè)限(通常小于100ppm，即1mg總蛋白中HCPs含量應(yīng)小于100ng，也即<0.01%)。
• 歐洲藥典EP 2.6.34中規(guī)定：在生物制品中，HCP的含量應(yīng)當(dāng)小于0.1%。
• 國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)指南：ICH Q6B指出，需要根據(jù)ICH準(zhǔn)則采用敏感且經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的有效方法來(lái)監(jiān)控殘留的HCPs，其殘留量通常要求小于100ppm。
• ELISA是各國(guó)藥典推薦的在生物制品中檢測(cè)殘留HCPs的方法，可以測(cè)定HCPs的總量。并且ELISA的操作簡(jiǎn)便，是經(jīng)典的免疫學(xué)檢測(cè)方法。但ELISA檢測(cè)HCPs也有方法的局限性，比如不能從ELISA的結(jié)果中知道樣品中有哪些HCPs，或者用于檢測(cè)的抗體與哪些HCPs發(fā)生了免疫反應(yīng)。因此，監(jiān)管部門(mén)要求在使用ELISA檢測(cè)過(guò)程中HCPs殘留含量時(shí)，不僅要通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證證明試劑盒的準(zhǔn)確度，精密度，靈敏度等，而且還需要證明使用的HCPs抗體有廣泛的反應(yīng)性，即HCPs抗體覆蓋率。
  

圖 1 HCP ELISA試劑盒檢測(cè)流程

什么時(shí)候做HCPs抗體覆蓋率驗(yàn)證？

美國(guó)藥典USP<1132>和歐洲藥典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS將HCPs檢測(cè)方法分為：商業(yè)化試劑盒、產(chǎn)品/工藝專(zhuān)屬性方法和平臺(tái)化方法。并指出在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的不同階段，推薦采用不同的ELISA試劑盒用于HCPs的檢測(cè)。

USP<1132>提到在沒(méi)有平臺(tái)化方法的情況下可以在臨床前、臨床I期、II期使用商品化試劑盒；在臨床III期/工藝驗(yàn)證及產(chǎn)品上市后，由于商業(yè)化的通用HCP檢測(cè)試劑盒抗體的覆蓋率往往不足等局限性，需要考慮結(jié)合細(xì)胞類(lèi)型及工藝特異性等因素，使用平臺(tái)化方法或針對(duì)上游工藝開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品/工藝專(zhuān)屬性方法。

而在臨床II期后若是需要繼續(xù)使用商品化試劑盒，就需進(jìn)行HCPs抗體覆蓋率驗(yàn)證來(lái)評(píng)估試劑盒是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控。通常推薦在臨床II期末或者臨床三期前的這個(gè)階段去做覆蓋率驗(yàn)證，此時(shí)生產(chǎn)工藝已經(jīng)固定并且有相對(duì)充足的時(shí)間。

圖2 USP <1132>產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的不同階段HCP檢測(cè)方法的建議

HCP覆蓋率驗(yàn)證的不同技術(shù)路線(xiàn)

傳統(tǒng)的分析方法采用2D Western blot進(jìn)行覆蓋率驗(yàn)證，是基于等電點(diǎn)和分子量不同的原理，蛋白在凝膠上通過(guò)SDS-PAGE方法被分離。其中一張膠被銀染，另一張被轉(zhuǎn)到PVDF膜上，并結(jié)合ELISA試劑盒中的抗體進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)。但因其固有的方法學(xué)限制和技術(shù)挑戰(zhàn)，往往難以全面、準(zhǔn)確地評(píng)估多克隆抗體對(duì)HCPs的覆蓋范圍。

2D WB方法限制因素：

• 負(fù)載能力低
• 樣品經(jīng)過(guò)前處理會(huì)破壞蛋白天然表位
• HCPs結(jié)合到PVDF膜上導(dǎo)致損失部分檢測(cè)到的抗體信息
• 難以完全將PAGE凝膠與WB圖片對(duì)齊
• 特異性差，顯著低估真實(shí)抗體覆蓋率

為了克服這一難題，Cygnus Technologies于2014年創(chuàng)新性地推出了抗體親和提取(Antibody Affinity Extraction，AAE?)技術(shù)，目的是提高細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中總HCPs混合物的靈敏度和覆蓋率評(píng)估，并可以檢測(cè)對(duì)下游工藝特異性HCPs的反應(yīng)性，這些通常也是最為關(guān)注的HCPs。與2D-PAGE和2D-WB的靈敏度受負(fù)載能力等限制不同，AAE?的靈敏度可高出100倍以上，因?yàn)樗軌蛱崛『蜐饪s大量樣品。

表 1 AAE與2D-WB覆蓋率技術(shù)路線(xiàn)對(duì)比

AAE分析流程首先將多克隆抗體共價(jià)固定在色譜柱上。然后對(duì)色譜柱進(jìn)行條件調(diào)節(jié)，以防止抗體的顯著浸出并極大地減少任何非特異性結(jié)合。原始未變性的HCPs樣品通過(guò)色譜柱與抗體進(jìn)行結(jié)合，隨后用酸洗脫。通過(guò)結(jié)合和洗脫，HCPs樣品再次在柱上循環(huán)，直到?jīng)]有其他HCPs被結(jié)合。所有收集的HCPs洗脫液再匯集、交換緩沖液并濃縮回原始樣品體積，為后續(xù)的分析提供高質(zhì)量的樣本。在收集到HCPs樣本后，可以選擇通過(guò)2D-PAGE+銀染或MS質(zhì)譜進(jìn)行后續(xù)分析。

圖3 USP <1132>產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的不同階段HCP檢測(cè)方法的建議

抗體對(duì)下游HCPs的反應(yīng)性和AAE-MS?的HCPs鑒定

   AAE?技術(shù)的優(yōu)勢(shì)不僅在于其高靈敏度，更在于其強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力和廣泛的應(yīng)用前景。通過(guò)AAE-MS?獲得的覆蓋率的結(jié)果更高、更真實(shí)，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)抗HCPs抗體在ELISA中的表現(xiàn)。并且，AAE?與質(zhì)譜聯(lián)用(AAE-MS?)能夠識(shí)別收獲材料中與抗體反應(yīng)的HCPs，并獲得蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)(pI)信息，可以評(píng)估純化過(guò)程中持續(xù)存在的單個(gè)HCPs，并優(yōu)化下游純化工藝。

圖4 F650S HEK2 93抗體覆蓋率驗(yàn)證

值得一提的是，AAE?技術(shù)在檢測(cè)并證明對(duì)單個(gè)下游HCP的反應(yīng)性方面表現(xiàn)出色。更主要的是質(zhì)譜可以對(duì)樣品中是否存在潛在高風(fēng)險(xiǎn)的HCPs做出鑒定并提供這些蛋白的注釋信息。通過(guò)AAE?技術(shù)，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別和量化這些高風(fēng)險(xiǎn)HCPs。這些通過(guò)特定純化過(guò)程持續(xù)存在的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs對(duì)于患者安全、藥物功效和穩(wěn)定性至關(guān)重要，無(wú)論是藥物研發(fā)人員還是監(jiān)管人員都能通過(guò)這一技術(shù)清楚地了解工藝中某個(gè)HCP的殘留情況，從而為藥物的研發(fā)和生產(chǎn)提供強(qiáng)有力的支持。

表 2 CHO細(xì)胞高風(fēng)險(xiǎn)HCPs

AAE-MS?在藥物原液和過(guò)程樣品監(jiān)控中的應(yīng)用

AAE-MS?也可以對(duì)藥物原液中HCPs富集的同時(shí)去除了大部分原料藥。去除原料藥極大地提高了通過(guò)2D-PAGE和質(zhì)譜分析識(shí)別單個(gè)HCPs的能力，因?yàn)樗幤吠ǔＲ?/span>104-106的倍數(shù)掩蓋HCPs。AAE-MS?是一種更客觀和直接的方法檢測(cè)和鑒定原料藥中任何潛在的HCPs雜質(zhì)以幫助優(yōu)化下游純化工藝。

圖5 AAE對(duì)藥物原液中HCPs的富集

圖6  AAE-MS?對(duì)藥物原液中高風(fēng)險(xiǎn)HCPs的富集和鑒定

總之，抗體親和提取(AAE?)技術(shù)以其卓越的性能和廣泛的應(yīng)用前景，正在逐步成為生物制藥領(lǐng)域HCPs分析的新標(biāo)準(zhǔn)。它不僅能夠克服傳統(tǒng)方法的局限性，更在靈敏度、預(yù)測(cè)能力和應(yīng)用深度上實(shí)現(xiàn)了顯著提升。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信AAE?將在未來(lái)為更多藥物的研發(fā)和生產(chǎn)貢獻(xiàn)力量，為患者帶來(lái)更加安全、有效的治療方案助力。

支持文獻(xiàn)

[1] USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.

[2] USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.

[3] EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.

[4] Host Cell Protein Analysis: Immunoassays and Orthogonal Characterization By Antibody Affinity Extraction and Mass Spectrometry Methods

[5] Antibody Affinity Extraction (AAE?) - A superior alternative to 2D Western blot for determination of polyclonal anti-HCP reactivity.

[6] Antibody Affinity Extraction (AAE?) Empowers HCP Identification by Mass Spectrometry.